一、大道至简，检测告别选择困难症
2018年智因的遗传病检测服务“加量不加价”的大升级，使得原先的“贵族服务”——trioWES和增强全外的价格已经达到了平民百姓能轻松承受的水平。从此医生再也不必为选择哪种小Panel而伤脑筋，就此告别选择困难症，检测策略变得简明清晰。对于不涉及特殊检测的疑难病例，原则上选择检出率最高的方案，同时可以根据患者对周期和经济性的需求进行选择：
- 对于周期要求高的，应选择最高检出率策略（避免阴性结果的反复试错）——加急全基因双组学项目，即trio（WES+CNVseq +临床非编码区）+RNAseq，这是在家系增强全外的基础上，增加了家系的临床非编码区测序分析，并结合先证者转录组测序分析，可以说这是独孤求败的检测策略。7~15天提供NGS分析结果。
- 周期要求高且相对经济的策略，是加急增强全外，即加急trio（WES+CNVseq）。7~15天提供NGS分析结果。
- 对于周期要求不高的，可以选择非加急的增强全外，即trio（WES+CNVseq）。30~45天出报告。
- 对于周期要求不高且经济拮据的患者，可以选择非加急的家系全外，即trioWES。30~45天出报告。
- 对于周期和检出率要求不高，且追求极致经济的策略，可以选择非加急的（全外）Panel策略，即全外显子测序，设定虚拟Panel进行分析。30~45天出报告。
二、涉及特殊检测的智因疾病诊断解决方案
涉及特殊检测项目的，可以单独加测，或选择智因疾病整体解决方案。
智因疾病整体解决方案，其实就是在上述几类NGS策略基础上，加上该疾病的特殊检测，所构成的整体解决方案。如：
- 疾病（含线粒体病）通用诊断解决方案
- 肾病综合征诊断及用药整体解决方案
- 癫痫诊断及用药整体解决方案
- 脑发育障碍(含孤独症及智障)诊断解决方案
- 共济失调疾病诊断解决方案
- 肌病诊断解决方案
- 结节性硬化诊断解决方案
- 肾上腺皮质增生诊断解决方案
三、深度了解智因全外及全基因双组学系列策略
随着智因推出遗传病基因检测——家系准全基因组和家系全基因双组学测序分析，智因遗传病检测策略家族又多了两个成员。那么该如何理解各种检测策略之间的区别呢？诸君莫急，小智来帮您梳理一下。
小智认为，各种不同策略的差别，首先是体现在检测范围、适用变异类型、检测模式等重要参数上。
- 从检测范围上看：
Panel，临床外显子组（也有称“亚全外”的），全外显子组，增强全外，准全基因组，全基因双组学，这几种策略在检测范围上是相互包含的关系，检测范围越大越全面，致病变异的检出率自然也会越高。
随着测序成本的持续下降，几种策略的价格差别在逐渐缩小，在智因东方，同样的价钱，过去只能做Panel，而现在可以做全外了，甚至比Panel更便宜。在过去，医生是为患者省钱才舍全外而做Panel的，常常为要选择开哪个包而纠结，今后医生再也不必为此而伤脑筋，所有的Panel就直接用全外代替就OK了。
全外比小Panel便宜了，但数据质量可一点不亚于Panel，智因的全外，对于质检合格的样本，在平均测序深度100X的时候，20X以上覆盖度均值可达99%，这样的均衡性是很多捕获Panel都望尘莫及的。
增强全外是在全外基础上，增加了大型拷贝数变异（CNV）的检出。
家系准全基因组（trio-sWGsTM），是在增强全外的基础上，增加了对人类全部四千多种致病基因的非编码区的trio（一家三口）测序，可以检测到近全部非编码区的已知致病突变。虽然这不是标准意义上的全基因组30X测序（WGS），但在致病突变相对密集的全外显子和临床非编码区的区域可以获得100X测序深度，其数据质量要远胜于WGS。
家系全基因双组学（trio-sWGRsTM），是在家系准全基因组的基础上，增加了一家三口的外周血白细胞全转录组测序（RNAseq），可以检测分析白细胞表达的近万个基因的表达谱和各种剪接变体。对于致病基因在白细胞表达并发挥功能的一些疾病，尤其是血液系统疾病、免疫系统疾病及一些大分子代谢疾病等，全基因双组学策略不仅可以检出已知的非编码区致病突变，还有可能检出新的致病变异，而且能够得到变异在转录组层面的功能验证（比如影响调控表达、影响剪接等）。
- 从检测模式上看：
这里说的检测模式是指先证者模式（即二代测序只测先证者，挑出怀疑变异再做一代验证），还是核心家系（trio）模式（即二代测序同时检测先证者和父母）。对于全外显子、全基因组如此大的检测范围，只检测先证者是不可取的。因为先证者模式无法判断变异是否呈现家系共分离，即便挑几个怀疑的变异去做家系一代验证，也很容易挑错，漏掉真正的致病突变。
先证模式还有一个坑，那就是即便挑了少数变异去做家系验证，但也无法知道父母样本是否来自真正的生物学父母，而trio模式则可以借助大数据比对来判断生物学父母的可靠性。
trio-WES，或称核心家系全外显子组测序，已成为目前遗传病诊断的基本配置。在此基础上再增加核心家系的CNVseq、临床非编码区、转录组，就分别成为更为强大的增强全外家系、家系准全基因组、家系全基因双组学策略。
- 从适用变异形式上看：
遗传病的基因序列变异主要可以分小（点突变）、中（基因及内部外显子的缺失重复）、大（100kb以上大片段CNV）这三类。
一般的Panel，临床外显子组，甚至全外显子组，只能检测小型变异，对中型和大型变异无法检出，也就是若在Panel范围内的某个基因及其相关区域存在致病的CNV，会大概率漏检。
智因的trio-WES，可以利用家系全外显子数据，对全部约2万个基因进行外显子缺失重复的筛查，同时实现小型和中型变异的检出。传统的中型变异检测方法是MLPA，其局限性是只能检测指定某一个基因是否存在外显子缺失重复，而智因全外可以全面扫描几乎全部2万个基因的外显子缺失重复。如果把MLPA比喻为“狙击点射”，则智因全外的中型变异筛查则是“地毯式轰炸”。全外分析对连续两个以上的外显子缺失重复的准确性较高，但对单个外显子拷贝数异常的检测准确度不及MLPA，如果医生强烈怀疑某个基因的问题，可以单加这个基因的MLPA检测。二者各有优缺点，不必相互菲薄。
智因的trio(WES+CNVseq)，或trio(全外+CNV)，或称家系增强全外，在WES的基础上，增加了全基因组CNVseq检测，不仅可以弥补大片段拷贝数变异的检测，而且还能得到单亲二倍体（UPD）的检出，即可以全面涵盖大中小三类变异。CNVseq方法已得到大样本的验证，其灵敏度和特异性与CMA芯片一致率。
- 综合对比几种检测策略：
在这里，小智来给各位解析表格最右边两列：
- 关于阳性检出率：
检测范围越全，阳性检出率越高 。（注：表格的阳性率只是一个理论值，且仅针对于疑难诊断疾病而言，实际阳性率会受入组患者选择等因素影响）。
家系trio模式比先证模式更有利于提高阳性检出率，检测范围越大（如全外、全基因组），trio模式的威力就越明显。
- 关于诊断严谨性：
每个人的基因组都有百万个SNP，即便检出了变异，这个变异是否就是患者的病因，基于此的诊断是否靠谱，事关诊断的严谨性。表中几个因素会对提升诊断严谨性：
检测范围越全，就越有可能避免局部检测策略（如Panel）的“一叶障目”的误诊，故诊断就越严谨。
家系trio模式，一方面能提供共分离的证据，另一方面还有助于确证家系的血亲关系，避免非生物学父母因素导致的乌龙结果，故其诊断会比先证者模式更严谨。
转录组能提供基因组变异在mRNA层面的功能学证据，故其诊断会比单一的基因组学证据要更严谨。
再比较一下这两个最新策略——家系准全基因组和家系全基因双组学的区别：
这两个新策略，都包含trio全外、trioCNVseq、trio-临床非编码区测序分析。与家系准全基因组相比，家系全基因双组学项目多了trio转录组分析。在临床非编码区的分析上，家系准全基因组仅报告已知致病变异，而全基因双组学则不仅仅报告已知致病变异，而且还能结合转录组，对非编码区变异致病性进行综合分析。
综上所述可以看出家系全基因双组学策略trio-sWGRsTM的惊艳之处：
- 几近极限的检测范围：全外显子+CNVseq+临床非编码区；
- 大中小变异的全面检出：
- 小型变异——点突变的检测范围：在已知疾病范围，全面涵盖编码序列和绝大部分非编码序列，几乎无死角；
- 大型结构变异——CNV的检出： CNVseq可检出100kb以上的大型拷贝数变异，甚至包括UPD；
- 中型变异——外显子缺失重复的检出：智因trio WES可全面解决中型变异——基因内部外显子缺失重复的检测分析；
- 家系trio模式：可一目了然实现遗传共分离分析，检出新发（de novo）变异、嵌合体等；
- trio-RNAseq，或称核心家系转录组测序，与DNA的测序策略家系准全基因组联合，实现基因变异的双组学解读：这是基因组之外的另一大组学在遗传病诊断中的创新应用。转录组可以起到基因组（DNA）测序所不具备的特殊作用：
- 印证DNA上的变异的真实可靠，并发现DNA上没有但在RNA上出现的变异，即RNA编辑致病机制。
- 印证DNA上的预测会影响剪接的变异，是否真正在RNA上体现出异常的剪接体。
- 印证在DNA的调控区的变异，是否真正影响到RNA的表达。
- 发现对DNA的NGS测序很难发现的融合、重排等结构变异。
- 非编码区双组学解读：基于trio策略，和转录组的功能学依据，可以根据ACMG评级标准对非编码区给出生物学及遗传学的致病性判断，并且结合临床特征，给出综合致病性解读。
对于致病基因在白细胞表达并发挥功能的一些疾病，尤其是血液系统疾病、免疫系统疾病及一些大分子代谢疾病等，全基因双组学策略不仅可以检出已知的非编码区致病突变，还有可能检出新的致病变异，而且能够得到变异在转录组层面的功能验证（比如影响调控表达、影响剪接等）。
- 极致检出率：在除却特殊机制的情况下，应用家系全基因双组学策略几乎可以忽略漏检的概率。反过来说，在转录组能够表达的基因中，阴性的结果可以在更大概率上做出正确的排除诊断。
- 平民价格，贵族服务：当产品的品质达到近乎极致，那唯一要考虑的就是价格了。目前智因的家系准全基因组，和家系全基因双组这样庞大而且高端的“贵族”检测策略，其检测分析费用在过去起码需要十万元级别，而现在只需要1~2万元，与业内大多数的trio-WES的价格相当或相近，已经降到了大多数平民百姓家庭能够承受的范围，可谓是“平民价格，贵族服务”。
最后敲黑板总结，对于诊断不清的疑难病例：
- 做Panel不如做全外，价格差不多甚至倒挂；
- 做全外，就要做trio全外，trio-WES将成为遗传病诊断的标配。
- 渴望更高检出率，则可选择增强全外、准全基因组、全基因双组学。全基因双组学是目前最高端的“贵族”项目，但却接近“平民”价格。
- 这些NGS策略不是万能的，还有一些变异形式是NGS不能解决的，需要结合疾病诊断的具体需求，增加相应的特殊检测。
- 还有一点，表面上看，越高端的项目价格越贵，但从患者的实际诊疗成本来看，高端项目却是大概率上为患者省钱、省时、降低代价的，相反低端项目却有可能是花钱多、耗时长、代价高的。关于这一点，敬请期待下一篇《花那么多钱查基因，究竟值不值？》。
四、怎样提高阳性率（节选自《遗传病精准诊断攻略》）
- 阳性率低，是什么原因？
在展开讨论之前，我们先要正确理解阳性率的概念。阳性率是个统计数字，直接受患者入组选择标准的影响。遗传病患者只是全部人群的一小部分。对全部感冒发烧的成年患者做单基因病的基因检测，肯定不会有高的阳性率。对于遗传因素只占一小部分的疾病，本来就不应该把基因检测的高阳性率作为追求目标。
但对于遗传占主要致病因素的疾病，我们就应该发展应用更先进的技术和诊断模式，去达成更高的阳性诊断率。本节所讨论的阳性率，均为对遗传占主要致病因素的疾病而言，这是本节全部讨论分析的前提。
想当年用Sanger测序诊断遗传病的时候，医生从厚厚的基因项目册中挑选基因进行检测。如果真的检出致病突变了，医生会欢呼“中奖了”，可见当时的阳性率是多么低。
尽管现在有了NGS（高通量测序），一次可以把某种临床症状相关的几十或几百个基因打个Panel来进行检测，但真正的致病突变的检出率仍然仅仅在10~20%之间。那么究竟有哪些因素导致阳性检出率低呢？
检测范围的局限1——漏检疾病
其实阳性率，和检测的范围，或者说检测策略是直接相关的。小Panel会存在打包不全的问题，甚至在对于复杂疾病有可能不知道选择哪个Panel，在这一点上，很明显全外显子要大大优于Panel策略。可以说，小Panel，是从低通量时代（Sanger测序时代）到高通量测序时代（全外、全基因组测序）的过渡期的产物。
涉及神经、心脏、肝脏、骨骼肌、肾脏等能量需求较高器官异常的疾病，不能排除线粒体病。漏检mtDNA和线粒体核基因是非常常见的现象。
有些皮肤病、血液病是体细胞突变所致，只有采集病变组织检测，才有可能得到阳性结果，只检测白细胞，按孟德尔遗传病去分析，一般不会得到阳性结果。
漏检变中、大型变异形式
一般小Panel只检测点突变。很多情况医生没有意识到有可能是中型（外显子缺失重复）、大型变异（CNV）所致，因为医生所熟知的、临床上能辨识的涉及到中型、大型变异的疾病很少。然而漏检中、大型变异，也会导致明显的检出率下降。
只检测先证者，没检测家系（Trios）
除了检测范围之外，要想提高阳性率，在检测策略选择时还应该尤其注重家系（Trios）策略，也就是患者（先证者）与其父母同时进行NGS检测。普通的先证者“单人再验证”检测策略很有可能忽略掉生物学和临床特征不典型的基因变异，但家系筛查可以借助遗传学共分离分析，筛选出致病突变。有研究表明，对于各类疾病，家系（Trios）策略可以使临床外显子组的阳性率获得40%~300%的不同幅度的提升。
基因数据分析能力的局限
既然阳性率低是因为检测范围不全，那么仅仅放大检测范围就可以解决阳性率问题吗？还不是那么简单。检测出来了，但如果数据分析跟不上，仍然会降低检出率。因为检测范围扩大，数据分析的难度也就同步加大。全外显子组检测出来的变异数量，是小Panel的上百倍，数据解读的压力也陡增百倍。
临床特征收集及分析不到位
前文已述，即便基因检测技术和检测策略都没问题，即便运用最强大的数据分析工具，如果最基础的临床表型数据不全面不准确，标准化不到位，都有可能对分析的准确性大打折扣。这需要有强大的临床表型录入和管理工具，更具要医生建立正确的意识，重视表型收集，认真使用工具进行录入。
下面我们就上述这五个导致阳性率低的原因，逐一展开探讨。
- 提高阳性率之——检测范围越全越好
检测范围越全，越能避免漏检
检测范围越全，越能避免漏检，这个道理很容易懂。
目前遗传病NGS检测策略主要有小Panel、临床外显子、全外显子、CNVseq几种策略，低阳性率往往和检测策略选择有关。
Panel策略，也叫疾病相关靶向测序策略，是对某种临床症状相关的几十或几百个基因打个包。
相比于全外显子，Panel策略的优势在于成本较低，数据分析难度也小，对于相对特异的疾病群，经验丰富的医生运用起来效果也不错。
但从各种遗传病诊断的总体实际效果来看，Panel策略的阳性率只有10~20%，为啥这么低？原因有三：
一是打包不全，谁也不能保证能打全，即便是穷尽了已知的致病基因，每年仍然会发现几百种疾病和相关基因；
二是Panel一般是基于某个系统的某种异常的临床特征来打包的，只是涵盖了这种临床特征相关的基因，但当遇到多系统疾病的时候，尤其是表型不典型的时候，即便相关基因在Panel里面，有可能医生会下错申请单，去检测另外的Panel了；
三是当一个人真的是有两种不同系统的疾病的时候，仅针对任何一个单一系统的Panel都不可能覆盖全。
相比之下，全外显子组（人类全部2万个基因），能较好的解决打包不全的问题，阳性率大约可提升至35~45% 。
2015年一篇关于儿童神经发育疾病的研究揭示，做Panel（小包）检测不出来的119例患者，用全外显子（大包）可以额外增加24%的阳性率。
对于难以诊断的疑难表型，尤其是涉及多系统疾病，或者是基因异质性突出，比如（但不限于）多系统疾病、各种畸形自闭症、智障、癫痫、发育迟缓、贫血、矮小等，涉及数百上千个致病基因，用全外显子会比Panel有较为明显的优势。
前面我们讲了检测范围越全面，就越有可能避免漏检，就越能提高阳性检出率。另外检测范围追求越全越好的意义还不仅于此。
检测范围越全，诊断越严谨
在低通量时代，因为技术局限性，测得太多成本就太高，所以临床上一般是先怀疑（说通俗一点就是猜）哪种病，就检测哪个基因，倘若在这个基因上还真就找到了一个变异的话，就很容易先入为主、对号入座，确诊是这种病了。
这种情况就类似盲人摸象，摸到的只是局部，摸到象腿就说大象是柱子，摸到尾巴就说大象是绳子，检测到这个基因有变异就说患者就是这个病，难免以偏概全。
其实，这种做针对性的检测——单个基因的一代测序，或是小Panel，大多是低通量时代的思维的延续，这种低通量思维主要基于以下的逻辑前提：
- 单基因病的表型非常特异，不会存在多种疾病混淆的情况，所以怀疑哪种病就做这种病的基因就OK。
- 基因变异的致病性很明确，在目标基因找到变异就可以确诊了。
然而实际的情况可能恰恰相反：
- 疾病的复杂性远超预期：单基因病种类繁多，特征相似的疾病往往很难鉴别诊断，对某种疾病的预先诊断，很有可能是错误的。
- 变异致病性的不确定性远超预期：与患者表型相似的疾病可能有很多，意味着有可能在很多个基因上都存在变异，但并不是所有的变异的致病性都很明确，需要在众多变异中进行选择。
在过去的低通量时代，没有办法把所有疾病进行全面筛查，我们只能是预先诊断，再做有确证性的检查，尽管不严谨，但也只能如此。但如今进入高通量测序时代，我们就有了一窥全貌的机会，我们完全可以在更广阔、全面的遗传背景上去确证，在我们怀疑的这种疾病之外，没有其他更值得怀疑的疾病的选项了。
因此高通量时代的思维应该是，先不做预判（即便有预判也先不急下结论），先测，尽可能全面检测，比如全外显子以及全基因组CNV，测完再从整体全貌上把握最像哪种疾病，或许全面测完之后才发现有比原来预想的更吻合患者特征的疾病，和更具备致病性的基因变异。
当然，即便是做全面的检测，也存在漏检的可能，但这总比只测一个基因或者小Panel要全面得得多，严谨得多。
因此在检测策略上，能做全外显子+CNV，就尽量不要选择小Panel。要注意的是，做这么大范围的检测，必须用Trios家系策略去借助共分离筛选变异，否则数据分析难度太大，也难以发现新发变异。
别忘了检测线粒体基因组（mtDNA）和线粒体核基因
除了上述因素之外，漏检另一套基因组——线粒体基因组（mtDNA）也是影响阳性率的因素之一。在线粒体病患者中，mtDNA致病突变的检出率大约为10~20% 。
教科书上常列举一些线粒体病综合征（如Leigh、KSS、MELAS、MERRF、MNGIE等），这反而会给人以误导，认为只有这些综合征才是线粒体病，其实线粒体病的表现远不止这些综合征。线粒体病未必都是多系统受累的，很多单一系统特征的疾病都有可能是线粒体病所致，如单纯的癫痫、自闭症、心肌病、肾病、肝病、肌病、身材矮小等。
有些Panel策略没有包含线粒体核基因，更不包含mtDNA，在选择用什么Panel上就会大伤脑筋。其实如果选择全外显子组，就一定包含线粒体核基因，再加测mtDNA，就能把线粒体病机制全面考虑进来。
- 提高阳性率之——大中小变异一网打尽
疾病表现与基因变异形式没有通用相关性
单基因病，主要是由于特定的一个基因的功能异常所致。至于这个基因是怎样异常的，是点突变（小）、外显子缺失（中），还是CNV（大）导致的这基因的异常，应该说这三种都有可能，而且都有可能导致相同或相似的疾病表现。
因此诊断遗传病选择检测策略，应该同时涵盖大中小三种变异，一个都不能少。
不要根据疾病表现去选择推断变异形式，比如多发畸形并非CNV的专利，如果点突变发生在多系统综合征的基因上，照样会导致多发畸形；单一表型也不是点突变的专利，如果CNV覆盖了单一表型的疾病的相关剂量敏感基因，导致整个基因拷贝数异常，也有可能会同样出现该疾病的单一表型特征。
中型变异的致病概率很可能不亚于点突变
中型变异（外显子缺失重复），是非常容易被忽略的致病变异形式。实际上，中型变异很可能在致病概率上不亚于点突变。
我们所熟知的相对常见的遗传病，无论是DMD（进行性肌营养不良）、SMA（脊肌萎缩症）、CAH（21羟化酶相关肾上腺皮质增生症）等，都有接近甚至超过一半的病因是中型变异引起。难道只有这几个基因集中体现为中型变异，而其他四千多个遗传病的基因都只体现为点突变？目前没有理论能支持这种判断。但值得深思的是，凡是常见的遗传病基因都体现出极高的中型变异致病概率，仅凭简单推断可知，是因为常见，所以研究得就透彻，小型、中型变异都有人研究，就发现了中型变异的高致病概率，那么其他基因不排除也是同样的，中型变异具有高致病概率！
为什么中型变异会有如此高的致病概率？一方面是因为中型变异很常见，另一方面，是因为中型变异有很强的生物学危害性，绝代多数都是强致病性变异。
传统的实验方法（如MLPA等）只能对中型变异进行确证式的检测，所以也只能对常见的几种遗传病进行分析。
在过去，NGS的捕获测序，无论是小Panel，还是全外显子，都无法解决中型变异的问题。
2017年智因东方（原德易东方）推出的全外显子测序的中型变异分析技术解决了这一难题，该技术可以对全外显子数据进行全面筛查，对2个以上的外显子缺失重复的准确性高于90% 。因此，智因的技术突破实现了一次全外显子测序同时检测小型和中型两类变异，极大增强了检测分析的性价比。
大型变异CNV也是不可忽略的检测目标
全基因组CNVseq是解决CNV检测的适用策略。过去几年CNV检测主要是依赖于染色体芯片（CMA或aCGH），当前基于全基因组二代测序的CNVseq有着替代染色体芯片的潜质。从技术准确性上看，目前CNVseq可以检出100k以上的缺失重复，准确性高达99%以上，与染色体芯片难分伯仲。CNVseq的优势在于检测范围更全，可以全基因组几乎没有死角的检测（基因组重复区域分析仍然是需要解决的难题），而且价格上比染色体芯片更具优势。染色体芯片的优势在于其技术成熟度，在遗传病诊断领域应用时间相对比较长，CNVseq类似技术过去主要应用在NIPT（孕妇外周血对胎儿筛查唐氏综合症等染色体整倍体异常），这是染色体芯片的敏感度难以触及的领域。可以期待CNVseq未来在遗传病诊断领域的成为主流CNV检测技术。
CNVseq可以解决儿童遗传病的约20%的阳性率，对于新生儿或产前疾病则阳性率更高。
那为什么临床上会忽略CNV呢？这可能和一个认识误区有关，即认为只有出现多发畸形才会考虑CNV，否则就只考虑点突变。其实临床表型（是否有多发畸形）与突变形式（点突变还是CNV）之间，没有必然联系，点突变可以导致多发畸形，CNV可以仅体现单一特征。因此要想避免低阳性率，在申请检测策略上，应该是点突变和CNV的检测，一个都不能少。
大中小变异，2017智因NGS全面涵盖
- 提高阳性率之——家系（Trios）模式
致病突变的必要条件——家系遗传共分离
如果一个变异是导致某种单基因病的，那么患者一定是以致病方式携带（比如对于常染色体显性遗传病，就是杂合携带，对于常染色体隐性遗传病，就是纯合或复合杂合方式携带），而其没有患病的家族成员（比如其父母）则应该是以非致病方式携带（比如对于常染色体显性遗传病，就是不携带的野生型，而对于常染色体隐性遗传病，就是杂合携带或不携带）。这种在一个家系里，相同表型和基因型的连锁绑定，以及不同表型和基因型的明确区分，被称为遗传学共分离。
遗传学共分离现象为判断变异的致病性提供了重要依据。
家系（Trios）模式为共分离分析提供了可能
传统的遗传病基因检测，由于成本原因，大多是先检测先证者的编码区序列，如果发现了可疑的变异，再用Sanger测序验证其父母是否携带该变异，进而判断是否存在遗传共分离，这可以叫做“单人再验证”模式。
家系（Trios）模式则是一次同时对先证者及其父母进行NGS检测，对先证者的每一个变异都进行三人的平行比对，看是否符合共分离。
非标准（超过三人）的家系模式分析
其实家系检测分析不限于标准家系——患儿加父母一家三口（Trios），非标准家系更好，非标准家系是指在此基础上再增加其他家庭成员，参与检测的家系患者成员越多越好，患病成员涉及代际越多越好，患者的无表型兄弟姐妹越多越好。
家系（Trios）模式的优越性
与传统的先证者检测相比，家系（Trios）模式可以：
降低假阳性率
在数据分析时最头疼的是在患者的数据中，有大量生物学和临床特征似是而非。难以判断致病性的变异，借助家系（Trios）模式，可以干净利索的过滤掉不符合共分离原则的变异，瞬间感觉整个世界都清净了！
提高真阳性率
有些变异可能是生物学和临床特征不那么典型支持致病的，有可能在数据分析时被过滤掉。但是借助家系（Trios）模式，可以筛选出符合共分离原则的变异，尤其是新发（Denovo）变异，这类变异在ACMG标准中可是强烈提示致病的级别！
2014年Lee H在一组800多例临床外显子组测序的研究对比中发现，家系（Trios）策略可以使临床外显子组的阳性率从22%提升至31%，甚至在发育迟缓类患者中，仅测单人的阳性率仅有9%，家系（Trios）模式高达41%！
缩短诊断周期
如果没有家系（Trios）数据，则有大量似是而非的变异需要人工分析，不仅如此，人工分析后还要用Sanger测序法去验证是否符合共分离。这对于全外显子组或全基因组来说，这个工作量是恐怖的，周期也是不确定的，一般会拖延两周以上，而且很有可能白费了半天劲，仍然漏掉了真正的致病突变。但借助家系（Trios）模式，则可一目了然挑选出共分离的变异，用“秒杀”来形容也不为过。
降低检测费用
看到这个说法，不少读者自然会有疑问，家系（Trios）检测三个人，怎么会比检测单人反而降低费用呢？因为如果没有家系（Trios）数据，则有大量似是而非的变异要用Sanger测序法去验证是否符合共分离。这个费用是不菲的。按国内大多数地区的基因检测收费标准来计算，一个位点一个人500元，家系三人就是1500元，如果要验证10个位点就要1万5千元！但借助家系（Trios）模式，可直接精准找到致病突变，则可大幅降低患者的检测费用。
家系（Trios）模式有这么多好处，说它带来了遗传病诊断的革命也不为过。
- 提高阳性率之——可信赖的数据分析
前面讲要提高阳性率，就要尽可能的扩大检测范围，并且要做家系Trios策略。但检测出来是相对容易的，检测出来的海量数据能否分析出来则是相对难得多、技术含量高得多的挑战。要选择可信赖的数据分析平台或机构。
怎样的数据分析才是可信赖的呢？
涵盖三要素
生物+遗传+临床，三要素同时支持致病性判断，这是一个变异的致病性的充分必要条件。数据分析平台应基于这三要素，对海量变异进行分级筛选。（详见：《详解：关于遗传病精准诊断阳性率的探讨》）
生物学要有五级致病性分析
分析程序兼容大（CNV）、中（外显子缺失重复）、小（点突变）三种类型。
对已报道变异，要能支持海量文献数据库的索引。对未曾报道的变异，要能提供变异对蛋白结构的预测性分析，而且要基于不止一个软件。
要基于多个公共数据库、尤其是中国人种的万人级别以上的数据库的MAF值，去过滤无害变异。
要兼容ACMG变异评级标准中的分析内容，包括保守性分析等。
遗传学要有共分离分析
要基于家系Trios模式，进行遗传共分离分析。
临床表型分析要基于结构化数据库
要基于结构化的人类七千种遗传病的临床表型数据库，结合患者的临床特征，进行匹配分析。
要有自动综合评级
要能提供结合三要素分析之后的自动综合评级结果，这样才能减轻人工分析的压力。
数据质量、分析依据要透明展现于在线平台
数据分析的逻辑和过程，以及综合形成的分析判断依据，都应展示于在线平台上，可供医生查看。
要可参与
在线平台能支持医生参与分析，提供方便的筛选、排序等功能，提供临床特征的在线修改、即时匹配。
要基于中国人的遗传病患者大数据
分析系统应基于中国人的遗传病患者的全外显子家系的大数据，这样才有可能结合大数据进行精准诊断。
- 提高阳性率之——临床特征采集和标准化录入
临床特征标准化是临床和科研分析的关键
在临床诊断应用中，临床特征标准化是NGS检测分析前的临床特征收集工作最关键的“临门一脚”。否则病历信息收集得再全面也体现不出效果，因为病历描述很可能计算机不识别。
在科研分析中，要对大量样本形成的大数据进行挖掘，如果临床表型的标准化做的不好，就很难准确挖掘其大数据中的科研价值。比如我们要分析合并“癫痫”与“贫血”两种表型的患者，共同在哪个或哪些基因上产生变异，从而发现新的致病基因，就需要这些数据都有很好的临床特征的标准化管理。否则如果最初开单录病历表型词的时候就不规范，后面再做科研时，基础数据不完善导致难以挖掘大数据价值，就可能悔之晚矣。
如何准确详实地收集患者临床特征
越详尽越好
全面：包括症状、体征、实验室检查、辅助检查、既往病史、家族病史等；
出现多系统特征的，不要漏掉某些系统异常，而误以为是单系统疾病；
能细致就不要粗劣，比如多指畸形，就不要说成笼统的手足畸形；
有家族史的，其家系成员有不典型或轻微表型就不要当做正常无表型。
容易被忽视的
外貌特征（外貌特征及形体特征可向上概括为查体异常）：
头面部：头围，注意小头畸形，发际，额部异常，眉毛稀密及眉弓，耳的大小，耳位高低，眼距，眼裂，睫毛，鼻翼发育，鼻根，人中，有无唇裂、腭裂和高腭弓，口腔内注意舌体及牙齿情况，小下颌畸形，毛发稀疏和毛发颜色。
形体特征：
注意上身长与下身长的比例、指距、手指长度、多指（趾）并指（趾）、皮肤和毛发色素、手纹、外生殖器等。注意黄疸、肝脾大和神经系统症状、一些不正常的汗味或尿味等。
实验室及辅助检查：
血、尿、便三大常规，血生化、免疫学、凝血功能、自身抗体、病原学等。代谢病需要提供血串联质谱分析结果及尿气象色谱分析结果。针对具体案例，需要提供具有重大诊断价值的相关检查结果。
不同科室或不同系统的遗传病侧重关注检查方向有所不同，应搜集该专科的专科查体及专科检查资料。例如眼科（视力、眼底、视网膜电图）；肾内及泌尿（尿常规、电解质、酸碱平衡、超声等影像学等）；血液科（血常规、涂片、骨穿等）；神经系统癫痫（临床发作特点、脑电图、MRI等）、神经肌肉病（肌力、肌张力、肌电图、肌肉活检）。
阴性特征
阳性（异常）特征固然重要，但阴性特征也很重要，可以用来排除某些疾病。
祖孙三代家族病史，家系成员的轻微表型
这个最容易被忽视，也是特别重要的信息。如果家系成员的表型信息缺失，或者存在错误，遗传学共分离分析就无法完成，或者完成的也是错误的。问询家族病史的时候，涉及的代际和成员越多越好。另外特别注意家系成员的与先证者疾病类似的轻微表型，因为这代表着该家系成员是携带者，对于AD遗传病，则是不完全外显的患者，对于AR遗传病则是杂合携带者。
比如有位协和的遗传学老教授介绍过的一个病例，患儿罹患视网膜母细胞瘤，检测到患儿携带杂合的疑似致病突变，患儿母亲也携带但不发病。医生觉得奇怪，便叫来患儿母亲仔细观察其眼部，发现其眼底有白斑。这就是一个典型的不完全外显的例子，患儿母亲的确没有发病，但是有轻微表型。如果不是医生的较真，认为母亲是无表型，按遗传学共分离分析，就有可能把这个突变当做不致病变异给过滤掉了。
如何做好临床特征标准化录入？
用标准化医学术语，统一临床特征的描述
如果要实现让计算机自动匹配患者疾病与七千种遗传病的特征的相似性，就必须让病历信息成为计算机可识别的元素，这就必须让临床特征的描述标准化，也就是运用标准化医学术语，统一临床特征的描述。
HPO（Human Phenotype Ontology，人类表型本体论），是迄今为止关于疾病（尤其是单基因遗传病）特征的结构化管理的最佳数据库。它把七千多种遗传病的海量表型特征，进行结构化处理，去掉重复后得到一万多种表型词。这些表型词之间有层级逻辑关联。
利用全谱云平台进行临床特征标准化
国内最早完成了HPO的汉化的机构是智因东方（原德易东方）——早在2015年初就联合各临床学科的专家团队率先完成，并把汉化版HPO嵌入全谱精准诊断云平台系统中。
比如癫痫发作这样一个特征，相同或相似的意思，可以有很多种叫法，如癫痫发作、抽羊角风等等，在HPO数据库中则统一为“痫性发作”这样一个标准称谓。
另一方面，在HPO收录的七千多种遗传病的临床特征描述，其实都是HPO中的表型词的组合，当医生在录入患者表型词时，如果选择标准词“痫性发作”，就可以与涉及“痫性发作”几百种疾病的表型相匹配。
如果涉及到关于“痫性发作”更细节的描述，则可在子特征（如癫痫持续状态、全身性发作、高热惊厥、局灶性痫性发作、癫痫性痉挛、症状性发作、意识障碍发作等）以及更下一级特征中去选择。
模糊检索
可以输入简单的关键词，在HPO标准词库中查找与患者某特征最贴近的表型词。对于经过专业训练的医生，一分钟内完成一个患者的表型的标准化录入是完全有可能的。
单选最准确的层级
在模糊查询的众多表型词中，单选最相近的表型词，不要把像与不像的都一股脑选上，否则会造成匹配评分的偏差。
五、关于检测性价比
- 在诊断成功率与检测成本之间，该怎样选择？怎样提高阳性率（节选自《遗传病精准诊断攻略》）
通过前面的探讨可以知道，要想获得较高的诊断成功率（对应检测的阳性率），应该做最全面的检测，并且是Trios家系模式，这种策略显然比只做患者单人的小Panel的费用要高。那么，在诊断成功率，和检测成本之间，我们如何抉择呢？
这其实是一个伦理问题，而非技术问题。本质上应该是患者选择，但患者没有能力也没有义务去理解不同检测策略之间的差别，因此医生的建议是决定性的。我们给的建议是，对于诊断不清的疾病，能做最好的但可能会相对贵一些的检查，就不要做次一等的便宜的检查。
首先生命无价，如果不存在经济承受问题，如果好的医疗手段能对生命给予更好的结果，那肯定应该选择好的但贵的，而不是差的但便宜的。
前面说过，即便是对于表型和基因型都不存在太多异质性的疾病，过去认为用小Panel甚至单个基因Sanger测序就能基本搞掂，但在现在可以在患者可以接受的价格的情况下，做更全面的全外显子测序分析，可以从更广阔的遗传背景去综合判断，从而得到更为严谨的诊断结论，那么为什么不选择更为严谨的方案呢？
其次，最高端的项目，加强全外家系——Trios全外显子+Trios CNVseq，其价格已经不再是患者不能接受的范围了。以智因公司为例，在两三年前，做一个单人全外显子都要12000元，三个人要36000元，单人的CNV就要近4800元，三个人就要14400元，这样要把加强全外家系做下来需要5万元！而智因2017年新策略只需12900元，相对于持续高涨的房价来说，这是绝大多数家庭都能支付得起的价格。
另外，基因测序成本在持续降低，但并不意味着遗传病基因检测分析的价格会一再降低，因为遗传病基因分析涉及严肃的医学诊断，有着极高的技术含量，依赖于专业、严谨的数据解读服务，这个价值是不能漠视的，即便基因测序成本降到0，遗传病基因分析的价格也不可能降到0。
其实，价格是相对的概念，疾病得不到确诊的损失远远不是这点检测费的数量级：
一方面，许多家庭因为患者疾病不能确诊，而四处求医，路途、看病、住院费用花了几十万元都不止，但到头来还是没弄清楚患者到底得了什么病；
第二，不能确诊也就得不到正确的治疗，其健康甚至生命的代价更不是用金钱能衡量的；
第三，更有些家庭因为患者得不到确诊，也就无法弄清疾病的家族遗传背景，无法阻断出生缺陷，从而一再生出患病孩子，给全家带来巨大痛苦。
反之，如果只花1~2万元，就有可能搞清楚严重疾病的原因，让患者得到正确的治疗，同时避免上述的巨额金钱的无谓浪费，而且还能避免再生出患病后代，估计只要是不差这点钱，绝大多数人都会愿意的。
因此道理很简单，在高通量时代，小Panel也好，家系Panel也好，都是为经济拮据甚至贫困的家庭而设置的。如果不是这种情况，就没必要选择低检出率方案。因为这类检测方案天然会存在漏检概率，而且难以把握遗传背景的全貌，容易造成先入为主的误判，如果为了节省几千元钱，做低检出率的检测，一旦漏检，最终还是要回到高阳性率方案上来，不仅钱没省，还多花了前面的冤枉钱，更重要的是可能会延误诊断的周期。
因此过去的理念是能做针对性的检测，就不要做全面检测；而现在应该反过来，即只要不是经济条件实在不允许，那么能做最全面的检测（家系全外+家系CNV），就不要做局限性的单人小Panel。
- 为诊断花这么多钱查基因，究竟值不值？
2013年山东电视台报道了一位生于普通家庭的免疫缺陷患儿，家长带着孩子看病，跑遍全国十多多家三甲医院，但都没能弄明白病因，其间经历各种治疗，总共花费高达50万元。后来几经辗转来到北京海军总医院，花了不到一万元接受了基因检测，方得确诊，原来该患儿罹患的是一种罕见的先天性免疫缺陷病——高IgM综合征。
确诊之后，就知道怎么治疗了——骨髓移植就能搞掂。骨髓移植需要30万元，但家长已是身无分文了，这些年为了看这孩子的病，这对年轻家长早已是债台高筑。于是就有其后电视台发起的慈善募捐，希望电视机前的热心观众能给予赞助。
假如上天能给这对家长一次重新选择的机会，先花一万元做一个基因检测，早早弄清楚病因，那是不是之前的50万冤枉钱就能节省下来？那后面30万的骨髓移植是不是就能做得起？孩子的病是不是就能得到救治？选择比努力重要，这句话用在这里，毫无违和感。
小智这些年见证了数以万计的遗传病基因检测，见过的这样的事情不胜枚举。遗传病诊治的第一关是诊断，也是最难的一关。遗传病大多是罕见病，某一种病医生一辈子未必能见到几例；另外遗传病种类繁多，表型复杂，很容易和其他疾病相混淆。这些特点决定了，诊断遗传病，单凭临床经验是非常困难的事，甚至是不可能的任务，必须借助实验室检查等辅助手段，而基因测序则是其中最为重要的手段。
技术的进步，为罕见病患者的诊断带来了福音。过去的一代测序技术只能检测单个基因，而近年来二代测序（NGS）技术的成本大幅降低，使得我们有可能用相对可接受的费用（几千元到一万多元）检测更多的基因——从几十、几百个基因的小panel，到全部2万个基因的全外显子、准全基因组、全基因双组学，甚至能一次检测患儿和其父母三个人（核心家系策略，trios），从而能使得诊断的阳性率不断提升。
可以预期，基因测序成本还会不断降低，但整个基因检测分析的成本不太可能会一路降低，因为随着测序范围的加大，数据分析的成本在增加。人类基因组的测序成本可以从一千美元降到一百美元，但分析成本不可能降到零。
想要获得更高的阳性检出率，那检测范围就要更加全面，以避免漏检。而检测范围越全，数据量越大，测序和分析的成本就会越高。
那现在问题来了，对于疑难诊断病例，我们究竟是应选择便宜的低检出率的策略（如仅针对性的检测相对常见的几十或几百种致病基因的小PANEL），还是应该选择高阳性检出率但贵一些的策略（如全面检测人类全部2万个基因的全外显子或全基因组）呢？
最近《JAMA Pediatric》发表了一篇来自澳大利亚的研究，来对比不同的检测应用策略给患者带来的医疗费用的差别。研究者将44名患儿分成几组：
第一组是最激进的，只要是诊断不清的疑难病例，不论是否怀疑遗传病，上来就做全外显子（WES）；
第二组是相对保守的，只对怀疑某种遗传病的患者查基因，做全外显子；
第三组是更保守的，只对怀疑某种遗传病的患者查基因，而且务必先做Panel，只有Panel阴性才再做全外；
第四组是最保守的，只对怀疑某种遗传病的患者查基因，而且只做Panel，绝不做全外显子；
研究者统计了每一组患者做基因检测的总费用，以及获得阳性诊断的例数，最终得到这样的结论：
最激进的那一组，不论是否怀疑遗传病，都上来就做全外显子的，尽管全外价格比Panel要贵，但总体基因检查费用却是最低的！因为Panel策略存在漏检，阴性的结果需要再换Panel或全外检测，总体费用反而更高！
说到这要插一句，在澳洲全外比Panel贵，在中国过去几年也如此，但现在中国的有些实验室的全外价格已经和有些Panel差不多甚至倒挂了。
从前三组的比较来看，越保守的策略，其患者的平均基因检测费用反而越高。第二组和第三组，在中国其实是非常普遍的，医生希望只给怀疑遗传病的患者做基因检查，而且要分步实施，先做针对性的检查（如Panel），如果是阴性结果再考虑换个全面一些的检查（如全外显子），医生的本意是想为患者省钱，但最终的结果竟然是让患者多掏了钱。
第四组，坚决不做全外显子而只做Panel的，平均费用貌似比第三组低些，但这组的患者竟然均未得到确诊，阳性率是0！从这个角度来说，这一组貌似花费低一些，但却是毫无意义的，这才是真正浪费了患者的钱财。
在国内甚至经常见到一次让患者做N多个Panel的情况，这N多个Panel的价格加起来已经远超全外显子了，更要命的是这些Panel即便加一块，其检测范围仍然远不及全外显子，这种策略显然更不足取，真不如做全外，全面又省心。
第一组和第二组的差别更耐人寻味，是凡遇诊断不清的病例都一概查基因（如第一组），还是仅对怀疑某种遗传病的患者查基因（如第二组）？前者看似武断，后者看似谨慎，但结果显示前者为患者的诊断花费更低，周期更短，因而更为合理。后者的问题很可能在于怀疑遗传病的前提是错误的。有些医生是凭患者特征是否像自己熟知的某种遗传病，或患者是否有家族史，来判断是否为遗传病。但遗传病的临床特征复杂，相互重叠容易混淆，并不是容易被一眼看出来的，而且很多遗传病患者并没有家族史，如果凭这两个前提而决定是否做基因检测，会存在诊断的遗漏，最终体现为最终确诊时患者要支付更高的无谓的医疗费用。因此，上述研究结果提示，对凡是诊断不清的疑难病例，无论临床特征像不像医生熟知的某种遗传病，无论患者是否有家族史，都应考虑遗传病的可能，都应做基因检查，而且只要经济允许，都应选择最好的NGS策略。
上述统计的只是医学诊断的费用，还没有包括最前面社区诊疗，以及确诊之后的治疗费用。想象一下反复试错的Panel模式，给这类疑难病例的患者带来的不仅仅是诊断费用的提高，更可怕的是诊断周期的延长，诊断的延误而带来的病情的延误，以及错误治疗带来的不良后果，还有未能确诊（或误诊）期间所带来的医疗费用，更不要说辗转各地求医问药的旅途费用和精神折磨。
常有人认为诊断不值钱，治疗才有价值，所以不应该在诊断上多花钱。遗传病仅通过临床特征来诊断是非常困难的，而一旦借助基因检查诊断清楚了，有些疾病的治疗可能会很简单也很便宜，用非常便宜的药物或方法就可以得到很好的治疗。于是有些人不免会想，如果真确诊是这类疾病，那治疗都这么便宜，为诊断花这么多钱查基因有些不值。但问题是，如果没有前面的基因检查来帮助确诊，谁会意识到是这类病，要用这种治疗方法呢？
一百年前的一天，美国福特公司生产线出现故障而停产，反复检查也查不清原因。每停产一天对福特公司来说都意味着巨大的损失。无奈，福特公司请来了故障排除方面的技术达人斯坦门茨先生。他的要价很高，每次请他都要价一万美元，这相当于当今的数百万美元。
斯坦门茨先生在福特汽车厂检查了一圈以后，拿粉笔在一台电机前画了一条线，说“这个地方的线圈多绕了16圈”。福特公司根据这个诊断赶紧修复，故障立即被排除了，生产也得以恢复。
福特公司觉得有点不值：“您不就是拿粉笔画了一条线吗？要一万美元？”
斯坦门茨先生回答：“画一条线，值1美元；但知道在哪儿划线，值9999美元”。
文献：Diagnostic Impact and Cost-effectiveness of Whole-Exome Sequencing forAmbulant Children With SuspectedMonogenic Conditions. JAMA Pediatric 2017（PMID：28759686）