深度了解智因全外及全基因双组学系列策略 - 北京智因东方转化医学研究中心官网

三、深度了解智因全外及全基因双组学系列策略

随着智因推出遗传病基因检测的“策略”——家系准全基因组和家系全基因双组学测序分析，智因遗传病检测策略家族又多了两个成员。那么该如何理解各种检测策略之间的区别呢？诸君莫急，小智来帮您梳理一下。

小智认为，各种不同策略的差别，首先是体现在检测范围、适用变异类型、检测模式等重要参数上。

从检测范围上看：

Panel，临床外显子组（也有称“亚全外”的），全外显子组，增强全外，准全基因组，全基因双组学，这几种策略在检测范围上是相互包含的关系，检测范围越大越全面，致病变异的检出率自然也会越高。

随着测序成本的持续下降，几种策略的价格差别在逐渐缩小，在智因东方，同样的价钱，过去只能做Panel，而现在可以做全外了，甚至比Panel更便宜。在过去，医生是为患者省钱才舍全外而做Panel的，常常为要选择开哪个包而纠结，今后医生再也不必为此而伤脑筋，所有的Panel就直接用全外代替就OK了。

全外比小Panel便宜了，但数据质量可一点不亚于Panel，智因的全外，对于质检合格的样本，在平均测序深度100X的时候，20X以上覆盖度均值可达99%，这样的均衡性是很多捕获Panel都望尘莫及的。

增强全外是在全外基础上，增加了大型拷贝数变异（CNV）的检出。

家系准全基因组（trio-sWGs^TM），是在增强全外的基础上，增加了对人类全部四千多种致病基因的非编码区的trio（一家三口）测序，可以检测到近全部非编码区的已知致病突变。虽然这不是标准意义上的全基因组30X测序（WGS），但在致病突变相对密集的全外显子和临床非编码区的区域可以获得100X测序深度，其数据质量要远胜于WGS。

家系全基因双组学（trio-sWGRs^TM），是在家系准全基因组的基础上，增加了一家三口的外周血白细胞全转录组测序（RNAseq），可以检测分析白细胞表达的近万个基因的表达谱和各种剪接变体。对于致病基因在白细胞表达并发挥功能的一些疾病，尤其是血液系统疾病、免疫系统疾病及一些大分子代谢疾病等，全基因双组学策略不仅可以检出已知的非编码区致病突变，还有可能检出新的致病变异，而且能够得到变异在转录组层面的功能验证（比如影响调控表达、影响剪接等）。

从检测模式上看：

这里说的检测模式是指先证者模式（即二代测序只测先证者，挑出怀疑变异再做一代验证），还是核心家系（trio）模式（即二代测序同时检测先证者和父母）。对于全外显子、全基因组如此大的检测范围，只检测先证者是不可取的。因为先证者模式无法判断变异是否呈现家系共分离，即便挑几个怀疑的变异去做家系一代验证，也很容易挑错，漏掉真正的致病突变。

先证模式还有一个坑，那就是即便挑了少数变异去做家系验证，但也无法知道父母样本是否来自真正的生物学父母，而trio模式则可以借助大数据比对来判断生物学父母的可靠性。

trio-WES，或称核心家系全外显子组测序，已成为目前遗传病诊断的基本配置。在此基础上再增加核心家系的CNVseq、临床非编码区、转录组，就分别成为更为强大的增强全外家系、家系准全基因组、家系全基因双组学策略。

从适用变异形式上看：

遗传病的基因序列变异主要可以分小（点突变）、中（基因及内部外显子的缺失重复）、大（100kb以上大片段CNV）这三类。

一般的Panel，临床外显子组，甚至全外显子组，只能检测小型变异，对中型和大型变异无法检出，也就是若在Panel范围内的某个基因及其相关区域存在致病的CNV，会大概率漏检。

智因的trio-WES，可以利用家系全外显子数据，对全部约2万个基因进行外显子缺失重复的筛查，同时实现小型和中型变异的检出。传统的中型变异检测方法是MLPA，其局限性是只能检测指定某一个基因是否存在外显子缺失重复，而智因全外可以扫描几乎全部2万个基因的外显子缺失重复。如果把MLPA比喻为“狙击点射”，则智因全外的中型变异筛查则是“地毯式轰炸”。全外分析对连续两个以上的外显子缺失重复的准确性较高，但对单个外显子拷贝数异常的检测准确度不及MLPA，如果医生强烈怀疑某个基因的问题，可以单加这个基因的MLPA检测。二者各有优缺点，不必相互菲薄。

智因的trio(WES+CNVseq)，或trio(全外+CNV)，或称家系增强全外，在WES的基础上，增加了全基因组CNVseq检测，不仅可以弥补大片段拷贝数变异的检测，而且还能得到单亲二倍体（UPD）的检出，即可以涵盖大中小三类变异。CNVseq方法已得到大样本的验证，其灵敏度和特异性与CMA芯片一致率。

综合对比几种检测策略：

在这里，小智来给各位解析表格最右边两列：

关于阳性检出率：

检测范围越全，阳性检出率越高。（注：表格的阳性率只是一个理论值，且仅针对于疑难诊断疾病而言，实际阳性率会受入组患者选择等因素影响）。

家系trio模式比先证模式更有利于提高阳性检出率，检测范围越大（如全外、全基因组），trio模式的威力就越明显。

关于诊断严谨性：

每个人的基因组都有百万个SNP，即便检出了变异，这个变异是否就是患者的病因，基于此的诊断是否靠谱，事关诊断的严谨性。表中几个因素会对提升诊断严谨性：

检测范围越全，就越有可能避免局部检测策略（如Panel）的“一叶障目”的误诊，故诊断就越严谨。

家系trio模式，一方面能提供共分离的证据，另一方面还有助于确证家系的血亲关系，避免非生物学父母因素导致的乌龙结果，故其诊断会比先证者模式更严谨。

转录组能提供基因组变异在mRNA层面的功能学证据，故其诊断会比单一的基因组学证据要更严谨。

再比较一下这两个最新策略——家系准全基因组和家系全基因双组学的区别：

这两个新策略，都包含trio全外、trioCNVseq、trio-临床非编码区测序分析。与家系准全基因组相比，家系全基因双组学项目多了trio转录组分析。在临床非编码区的分析上，家系准全基因组仅报告已知致病变异，而全基因双组学则不仅仅报告已知致病变异，而且还能结合转录组，对非编码区变异致病性进行综合分析。

综上所述可以看出家系全基因双组学策略trio-sWGRs^TM的惊艳之处：

几近极限的检测范围：全外显子+CNVseq+临床非编码区；
大中小变异的全面检出：

小型变异——点突变的检测范围：在已知疾病范围，全面涵盖编码序列和绝大部分非编码序列，几乎无死角；
大型结构变异——CNV的检出： CNVseq可检出100kb以上的大型拷贝数变异，甚至包括UPD；
中型变异——外显子缺失重复的检出：智因trio WES可全面解决中型变异——基因内部外显子缺失重复的检测分析；

家系trio模式：可一目了然实现遗传共分离分析，检出新发（de novo）变异、嵌合体等；

trio-RNAseq，或称核心家系转录组测序，与DNA的测序策略家系准全基因组联合，实现基因变异的双组学解读：这是基因组之外的另一大组学在遗传病诊断中的创新应用。转录组可以起到基因组（DNA）测序所不具备的特殊作用：

印证DNA上的变异的真实可靠，并发现DNA上没有但在RNA上出现的变异，即RNA编辑致病机制。
印证DNA上的预测会影响剪接的变异，是否真正在RNA上体现出异常的剪接体。
印证在DNA的调控区的变异，是否真正影响到RNA的表达。
发现对DNA的NGS测序很难发现的融合、重排等结构变异。

非编码区双组学解读：基于trio策略，和转录组的功能学依据，可以根据ACMG评级标准对非编码区给出生物学及遗传学的致病性判断，并且结合临床特征，给出综合致病性解读。

对于致病基因在白细胞表达并发挥功能的一些疾病，尤其是血液系统疾病、免疫系统疾病及一些大分子代谢疾病等，全基因双组学策略不仅可以检出已知的非编码区致病突变，还有可能检出新的致病变异，而且能够得到变异在转录组层面的功能验证（比如影响调控表达、影响剪接等）。

高检出率：在除却特殊机制的情况下，应用家系全基因双组学策略几乎可以忽略漏检的概率。反过来说，在转录组能够表达的基因中，阴性的结果可以在更大概率上做出正确的排除诊断。
平民价格，优质服务：当产品的品质优异时，需要进一步考虑的就是价格了。目前智因的家系准全基因组，和家系全基因双组检测策略，其检测分析费用在过去起码需要十万元级别，而现在只需要1~2万元，与业内大多数的trio-WES的价格相当或相近，已经降到了大多数平民百姓家庭能够承受的范围，可谓是“平民价格，优质服务”。

最后敲黑板总结，对于诊断不清的疑难病例：

做Panel不如做全外，价格差不多甚至倒挂；
做全外，就要做trio全外，trio-WES将成为遗传病诊断的标配。
渴望更高检出率，则可选择增强全外、准全基因组、全基因双组学。全基因双组学高端但价格平民。
这些NGS策略也有技术盲区，即还有一些变异形式是NGS不能解决的，需要结合疾病诊断的具体需求，增加相应的特殊检测。
还有一点，表面上看，相对完善的检测项目价格越贵，但从患者的实际诊疗成本来看，完善的项目却是大概率上为患者省钱、省时、降低代价的，相反低端项目却有可能是花钱多、耗时长、代价高的。关于这一点，敬请期待下一篇《花那么多钱查基因，究竟值不值？》。